NY_T 2743-2015 甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时荧光定量PCR法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.62 |
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8 |
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文件格式： |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2743—2015,甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时,荧光定量PCR法,Technical regulations for inspection and quarantine of Xanthomonas albilineans,(Ashby)Dowson—Real time PCR method,2015-05-21 发布 2015-08-01 实施,中华人民共和国农业部发布,NY/T 2743—2015,刖 百,本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出,本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC 271)归ロ,本标准起草单位:农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品质量监督检验,测试中心、国家甘蔗工程技术研究中心,本标准主要起草人:许莉萍、王恒波、阙友雄、黄国强、郭晋隆、苏亚春,I,ny/t 2743—2015,甘蔗白色条纹病菌检验检疫技术规程 实时荧光定量PCR法,1范围,本标准规定了甘蔗白色条纹病菌实时荧光定量PCR检测方法,本标准适用于甘蔗种茎、种苗以及甘蔗或其他植物组织中的甘蔗白色条纹病菌(Xa〃防omows aん,庆/zwea心)的检验检疫与检测。本标准中PCR等缩略语参见附录A。甘蔗白色条纹病菌有关信息参见,附录B,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法,GB/T 28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT- PCR检测方法,3术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1,/irpB 基因 hrpB gene,植物病原细菌的ー种过敏性反应和致病性基因(hypersensitive reaction and pathogenicity gene,无?)参与和介导过敏性反应(hypersensitive response, HR)的发生,与植物病原细菌致病性密切相关,ル?B基因是甘蔗白色条纹病菌的特异致病基因,编码细菌的类型出蛋白分泌系统(type ffi protein secretion,system,TTSS),通过该分泌途径,将细菌产生的诱导植物致病的蛋白,释放到胞外或宿主细胞,中,从而诱发宿主的各种效应,4原理,利用荧光信号伴随着目标序列PCR扩增产物的增加而增强的原理,通过收集PCR扩增过程的荧,光信号值,即可判断试样是否带有目标序列。为此,在克隆甘蔗白色条纹病菌特异性致病基因hrpB全,长序列基础上,根据序列信息设计了 PCR引物与探针,筛选获得特异性引物与探针,建立了一种基于,九?B基因检测甘蔗白色条纹病菌的实时荧光定量PCR方法,5试剂,除非另有规定,在分析中仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T 6682的二级水指标,其中涉及,PCR的用水要求达到ー级水指标,5. I氢氧化钠(10 mol/L)溶液:在160 mL水中加入80 g NaOH,溶解后加水定容至200 mL,塑料瓶中,保存,5.2 EDTA 溶液(500 mmol/L,pH 8. 0):称取二水乙二镀四乙酸二钠(Na?EDTA ?2旦0)18. 6 g,加,入70 mL水中,加热至完全溶解后,冷却至室温,用10 mol/L NaOH溶液调pH至8. 〇,加水定容至100,mL。在121℃条件下灭菌20 min0,5. 3 Tris HC!溶液(1 mol/L, pH 8. 0):称取!21. 1 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中,用浓盐酸调pH至8. 0,加水定容至1 000 mL。在121℃条件下灭菌20 min,1,ny/t 2743—2015,5.4 TE 缓冲液(pH 8. 0):分别加入 Tris - HCKpH 8. 0)10 mL 和 EDTACpH 8. 0)溶液 2 mL,加水定,容至1 000 mLo在121℃条件下灭菌20 min,5. 5 Tns-HCKl mol/L,pH 7. 5)溶液:称取121. 1 g Tris碱溶解于800 mL水中,用浓盐酸调pH至,7. 5,用水定容至1 000 mL。在121℃条件下灭菌20 mino,5. 6氯仿:异戊醇溶液:将氯仿和异戊醇按照24 ： 1的体积比混合,5. 7 CTAB裂解液(1 000 mL):在600 mL水中加入81. 7 g氯化钠,20 g十六烷基三甲基澳化镀,(CTAB),20 g聚乙烯毗咯烷酮(K30)(PVP) ,1 g DIECA,充分溶解(需加热助溶),然后加入Tris - HC1,(pH 7. 5)100 mL,EDTA(pH 8. 0)4 mL,加水定容至1 000 mL,室温保存,使用时加入0. 2%(V/V)的,L部基乙醇,5. 8其他试剂:适用于实时荧光PCR反应Taq DNA聚合酶(5 U/イノ)及其反应缓冲液、2. 5 mmol/ L,dNTPs、异丙醇、75%乙醇(V ： V),6仪器设备,6. 1实时荧光定量PCR扩增仪:激发/检测波长范围350 nm~750 nm;可用探针SYBR Green I染料,和TaqMan探针;升降温速度さ2. 0℃/s;均一性+/ —0. 5℃ ;准确性+/ 一 0. 3℃ ;温度范围4℃.,100℃,6. 2电泳仪:输出类型为恒压/恒流/恒功率输出;输出范围为!0 V-600 V/l mA.5……
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